A.   Tujuan Percobaan

Mempersiapkan media dan larutan pengencer yang akan digunakan untuk analisa secara mikrobiologi.

B.   Dasar Teori

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.

Bahan-bahan media pertumbuhan

1.     Bahan dasar

·         Air (H₂O) sebagai pelarut

·         Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45^oC.

·         Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.

·         Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.

2.    Nutrisi atau zat makanan

Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur pelikan/trace element.

·         Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.

·         Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.

·         Vitamin-vitamin.

3.    Bahan tambahan

Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba non-target/kontaminan.

4.    Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media

·         Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam

·         Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.

·         Meat extract. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi.

·         Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex).

·         Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.

Macam-Macam Media Pertumbuhan

1.    Medium berdasarkan sifat fisik

Ø  Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat..

Ø  Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.

Ø  Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).

2.    Medium berdasarkan komposisi

Ø  Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

Ø  Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.

Ø  Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.

3.    Medium berdasarkan tujuan

·         Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

·         Media selektif/penghambat

Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.

·         Media diperkaya (enrichment)

Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.

·         Media untuk peremajaan kultur

Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur.

·         Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.

Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.

·         Media untuk karakterisasi bakteri

Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.

·         Media diferensial

Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni.

C.   Bahan Dan Alat

·         Alat:

1.    Tabung reaksi

2.    Erlenmayer

3.    Cawan petri

4.    Sendok batang/pengaduk

5.    Timbangan

6.    Gelas piala

7.    Autoklaf

·         Bahan

1.    Media PDA, PCA, NA, NB, NaCl

2.    Aquadest

3.    Kapas

4.    Aluminium foil.

D.   Cara Kerja

a.    Pembuatan Media Cair

1.    Timbang nutrient Broth (NB) sejumlah kebutuhan seperti yang tertera  pada masing-masing wadah.

2.    Masukkan kedalam  gelas piala dan tuangkan aquadest sebanyak volume yang telah ditentukan, aduk hingga merata.

3.    Tuangkan dalam beberapa tabung reaksi sebanyak ±5 mL.

4.    Lakukan sterilisasi didalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.

b.    Pembuatan Media Padat

1.    Timbang bahan media padat (Nutrient Agar/ NA atau Plate Count Agar/ PCA) sesuai kebutuhan yang tertera pada masing-masing wadah kemasan.

2.    Masukkan dalam gelas piala dan tuangkan aquadest sebanyak volume yang telah ditentukan.

3.    Panaskan media hingga larut (warnanya jernih), sambil terus diaduk.

4.    Tuangkan sebagian media kedalam beberapa tabung reaksi sebanyak  tinggi tabung, dan kedalam 5 tabung reaksi sebanyak 10 mL, sedngkan sisa media tuangkan kedalam erlenmayer.

5.    Lakukan sterilisasi didalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.

6.    Setelah sterilisasi sebagian tabung  dimiringkan untuk mendapatkan agar miring, sedangkan sebagian lagi dibiarkan tegak untuk mendapatkan media agar  tegak, biarkan media memadat.

7.    Untuk  membuat media agar cawan, tuangkan media padat dalam erlenmayer (bersuhu ±50°C) kedalam cawan petri sebanyak ± 15 mL (seperempat tinggi cawan petri tersebut), segera tutup cawan setelah penuangan. Penuangan dilakukan dalam keadaan steril. Biarkan media memadat.

c.    Pembuatan Larutan pengencer

1.    Timbang NaCl sebanyak 0.85 gram, larutkan dalam aquadest hingga volume 100 mL.

2.    Pipet masing-masing 9 mL kedalam beberapa tabung reaksi ulir (bertutup).

3.    Tutup tabung reaksi dengan lemah (tidak sepenuhnya)

4.    Lakukan sterilisasindalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.

E.   Hasil Pengamatan

Media cair                              : NB (Nutrient Broth)

Media padat                          : NA ( Nutrient Agar)

Larutan pengencer              : NaCl

Suhu sterilisasi                    : 250°F atau 121°C

Lama sterilisasi                    : 15 menit

           

Gbr. 1. Sterilisasi dengan autoklaf       Gbr 2. Pemanasan media NA

                   

Gbr 3. Media dalam bentuk bubuk           Gbr 4. Media NB      

Gbr 5. Media NA

F.    Pembahasan

            Konsep dari praktikum ini adalah untuk membiakan suatu mikroorganisme maka dibutuhkan suatu tempat atau wadah yang dapat menyediakan semua komponen-komponen yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroorganisme, tempat atau wadah tersebut biasanya dinamakan medium.

            Medium adalah suatu tempat atau wadah untuk membiakan mikroorganisme tertentu, dimana didalam medium terdapat zat-zat yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroorganisme, seperti protein, karbohidrat, lemak, mineral, dan vitamin. Medium itu sendiri sebelum digunakan harus dalam keadaan steril, artinya tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme lainyang tidak diharapkan.

            Pada praktikum ini, medium yang dibuat yaitu NB (Nutrient Broth) dan NA (Nutrient Agar). Pada saat pembuatan media NB, pertama-tama adalah menimbang dengan tepat NB tersebut sebanyak 3.25 gram. Kemudian dimasukkan dalam gelas piala dan dituangkan aquadest sebanyak 250 mL, aduk hingga rata. Kemudian panaskan diatas magnetic stirrer. Setelah itu tuangkan kedalam 2 tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 mL. kemudian lakukan steriliasai didalam autoklaf pada suhu 250°F atau 121°C, selama 15 menit.

            Kemidian untuk membuat media NA, pertama-tama yang harus dilakukan adalah menimbang bahan media padat (NA) sebanyak 20 gram dengan tepat. Kemudian dimasukkan kedalam gelas piala dan tuangkan aquadest sebanyak 1000 mL, panaskan sambil terus diaduk hingga warnanya jernih. Tuangkan sebagian media kedalam beberapa tabung reaksi sebanyak 10 mL, 6 tabung dan 7 mL sebanyak 2 tabung untuk masing-masing kelompok.dan sisanya dimasukkan ke dalam erlenmayer sebanyak ±100 mL. kemudian lakukan sterilisasi didalam autoklaf pada suhu 250°F atau 121°C selama 15 menit. Setelah itu 2 tabung reaksi yang berisi 7 mL NA dimiringkan untuk mendapatkan agar miring, dan yang lainnya disusun di rak tabung reaksi untuk mendapatkan agar tegak. Biarkan media memadat. Sedangkan NA yang ada didalam erlenmayer didinginkan, kemudian dituangkan kedalam 5 buah cawan petri, sampai seluruh permukaan cawan tertutup oleh media. Penuangan dilakukan dalam keadaan steril. Biarkan media memadat. Masukkan kedalam refrigator, untuk digunakan pada praktikum selanjutnya.

            Dalam perlakuan seluruh bahan, harus diperhatikan kesterilannya karena dikhawatirkan akan terkontaminasi dengan mikroba lain.

G.   Kesimpulan

1.    Untuk dapat tumbuh dengan baik, mikroorganisme membutuhkan media yang tepat, sesuai dengan kebutukan akan nutrisinya.

2.    Ditinjau darikonsistensinya media NA merupakan medium padat, sedangkan media NB merupakan medium cair.

3.    Suhu yang digunakan untuk sterilisasi bahan adalah 250°F atau 121°C, dengan waktu selama 15 menit didalam autoklaf.

H.   Daftar Pustaka

http://ekmon-saurus.blogspot.com

Yuliani, Marwati,Wiwit M. 2009. Penuntun praktikum mikrobiologi umum.

Universitas mulawarman, fakultas pertanian: Samarinda.

Erwin Samsul. 2010. Laporan Akhir Praktikum Mikrobiologi Farmasi Dasar.

Universitas Mulawarman, UP. Fakultas Farmasi: Samarinda.